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domingo, 25 de noviembre de 2018

ADN recombinante en la naturaleza y ADN recombinante artificial

ADN recombinante en la naturaleza


El ADN recombinante dentro de la naturaleza hace referencia a un cambio en alguna o algunas secciones de los cromosomas de un ser vivo con el fin de donar a sus futuras generaciones un mejor genoma con mayor resistencia o para dar variabilidad a la especie. Como ejemplo tenemos:
  1. El crossing over que ocurre en la meiosis I, en la profase I en la subfase de paquiteno, en  los cromosomas sexuales de un ser vivo tanto masculino como femenino, lo cual confiere variabilidad en sus genes e incluso una mayor expresión de los mismo ante determinadas circunstancias.
  2. El intercambio espontáneo que tienen las bacterias al conferir parte de su ADN por medio de plásmidos a otras bacterias para conferirles resistencia a fármacos a los que fueron expuestos y los otros no, y viceversa.
 
Fig. 1.
ADN recombinante en el crossing over.
 
Fig. 2.
ADN recombinante en las bacterias

 

ADN recombinante artificial


El ADN recombinante artificial tiene como finalidad usar aparatos altamente técnicos y desarrollados para introducir un segmento de ADN dentro de un ser vivo y que este adopte la función del mismo, dando como resultado la proteína que tiene a cargo el gen que se introdujo en el ser vivo. Como ejemplos tenemos:
  1. Uso de los mecanismos de bacterias como Escherichia coli para la producción de proteínas, como la insulina, debido a que es fácilmente manipulable y que sus genes permiten hacer estas modificaciones, además de que ayuda al tratamiento de algunas enfermedades, en el caso de la insulina con la diabetes tipo 1.
  2. Modificación de algunas especies vegetales como en las últimas investigaciones con Physcomitrella patens, la cual se la está utilizando para la creación de fragancias, sabores y materias primas renovables, este planta entra en la categoría de los transgénicos que se encuentran en desarrollo.
Fig. 3. Método de ADN recombinante con E. coli

Fig. 4.
Método de elaboración de los alimentos genéticamente modificados, llamados transgénicos
Links de referencia:


domingo, 18 de noviembre de 2018

Northern blot en neumonía por Klebsiella pneumoniae

Para usar la técnica de hibridación northern en Klebsiella pneumoniae, se realizaron los siguientes pasos:
  1. Se realizó el aislamiento de ARN, por medio de líquido bacteriano de cultivos usando el kit RNeasy.
  2. Después se usó 2 ug de ARN en gel de agarosa al 1% con formaldehído al 1,2% durante una hora.
  3. Posteriormente pasó por la membrana de nylon Porablot con sondas de hibridación que detectaron los genes ramA, acrB y rrsE, los cuales fueron cortados por la enzima EcoRI.
  4.  Se etiquetaron los genes usando el sistema Megaprime DNA.
Las membranas de nylon fueron pre-hibridadas a 65 ℃ en un tubo con 10 ml de Speed-HybII al 7%, durante 1 hora, se usaron sondas específicas para los genes. Posteriormente se lavaron las membranas de nylon tres veces a 65 ℃ durante 15 minutos y finalmente expuestas a autorradiografía Kodak MS.

Links de referencia:
http://www.newmicrobiologica.org/PUB/allegati_pdf/2017/2/135.pdf
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3136514/


Fig. 1.
Pasos de la técnica Northern blot.
 
Fig. 2.
Resumen de los pasos de la técnica Northern blot.
Fig. 3. Resultados del Northern blot en Klebsiella pneumoniae.


domingo, 11 de noviembre de 2018

Prueba de PCR en neumonía por Klebsiella pneumoniae

Para la caracterización de cepas de Klebsiella pneumoniae se usaron hemocultivos de pacientes que se sospechaba adquirieron el patógeno mencionado y se aplicaron dos técnicas de PCR: análisis por PCR de los elementos repetitivos intergénicos consenso de enterobacterias (ERIC) y elementos repetitivos extragénicos palindromos (REP), conocidas también como ERIC-PCR y REP-PCR, respectivamente, para el uso de estos tipos de PCR se procedió con los siguientes pasos:

1. Extracción de ADN genómico bacteriano de Klebsiella pneumoniae empleando el kit basado en columna de Sílica, QIAamp DNA extraction Kit (Qiagen).

2. Se realizó ambas PCR con el método del autor que consistía en:
    Para ERIC-PCR: 
    - 1 ciclo de 7 minutos a 95 ℃.
    - 30 ciclos de: 
       - Desnaturalización: 1 minuto a 94 ℃.
       - Hibridación: 1 minuto a 40 ℃.
       - Elongación: 8 minutos a 65 ℃.
    - 1 ciclo de extensión final de 16 minutos a 65 ℃.
   Para REP-PCR: 
    - 1 ciclo de 7 minutos a 95 ℃.
    - 30 ciclos de: 
       - Desnaturalización: 30 segundos a 90 ℃.
       - Hibridación: 1 minuto a 43 ℃.
       - Elongación: 8 minutos a 65 ℃.
    - 1 ciclo de extensión final de 16 minutos a 65 ℃.

3. Se usó la enzima de restricción Xbal, se buscaron los genes BLEE y bla.

4. La observación se la realizó por medio de electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE)

5. Terminada la electroforesis, el gel se tiñó con una solución de bromuro de etidio durante 30 minutos; luego se realizó dos lavados con agua destilada durante 15 minutos cada lavado, y la imagen del gel fue registrada por el foto documentador Chemi Doc XRS.

La razón por la cual se usa este tipo de electroforesis, es porque este método es recomendado para la confirmación de brotes causados por Klebsiella pneumoniae. Esta investigación tenía como tema diagnosticar las diferentes cepas de Klebsiella pneumoniae, y entre sus objetivos disminuir y tratar las neumonías dadas por esta bacteria Gram-negativa. Tanto la especificidad como sensibilidad analítica no se especifica en los artículos que busqué.

Links de referencia:
http://www.scielo.org.pe/pdf/rmh/v24n2/v24n2ao1.pdf
https://scielo.conicyt.cl/pdf/rci/v30n4/art04.pdf
http://www.medigraphic.com/pdfs/micro/ei-2014/ei143d.pdf
http://www.scielo.org.co/pdf/bio/v35n4/v35n4a07.pdf


Fig. 1. Reacción en Cadena de Polimerasa


Fig. 2. Pasos de la Reacción en Cadena de Polimerasa


Fig. 3. Uso de los primers para la amplificación de genes y EFO en la PCR

Fig. 4. Caracterización de las cepas de Klebsiella pneumoniae





domingo, 4 de noviembre de 2018

Prueba de tamizaje y confirmatoria para neumonía por Klebsiella pneumoniae

Dentro de algunas pruebas de tamizaje para Klebsiella pneumoniae están: test de Jarlier, los test Carba, test de Hodge, Agar ChromID CARBA® y tiras epsilométricas, las cuales usan discos de medicamentos como las cefalosporinas, dependiendo del halo formado se detecta el tipo de bacteria. Entre algunas pruebas confirmatorias para Klebsiella pneumoniae están: uso de discos de cefotaxima y ceftazidima, combinadas con ácido clavulánico, prueba de detección de KPC basada en boronatos, entre otras.

Links de referencia:

Fig. 1. Control positivo y negativo por medio del uso de fármacos específicos

Fig. 2. Procedimiento del método de Hodge con Tritón X-100

Fig. 3. Método de detección de EPC por visualización del color

Fig. 4. Esquema de interpretación en tiras epsilométricas