Técnicas de edición genómica para neumonía por Klebsiella pneumoniae

Debido a la múltiple resistencia por parte de la bacteria Klebsiella pneumoniae, actualmente no hay una terapia que modifique genes para poseer una resistencia específica para este, pero estudios recientes han estado tratando de encontrar fagos, que son virus, que ayuden a la fagocitosis de la bacteria, para este estudio se realizó lo siguiente: 

1. En este caso se está usando cepas de Klebsiella pneumoniae para el estudio, y se lo realizó de tipo ex-vivo.
2. La terapia va ir dirigida al ADN bacteriano de Klebsiella pneumoniae.
3. La terapia va a estar dirigida por vectores que son fagos o virus de tipo bacteriófago lítico.
4. En este caso como la bacteria se encuentra mayoritariamente en los pulmones, estos serán los órganos a tratar.
5. La vía de administración de los fagos en contra de la bacteria es intravenosa.
6. Los resultados a corto y mediano plazo fueron favorables porque se lisaron las bacterias causantes de la neumonía, Klebsiella pneumoniae, de las cuales se tomó parte de ellas para realizar vacunas recombinantes.
7. Una vez tomado parte de la lisis de la bacteria Klebsiella pneumoniae se realizó la endolisina recombinante, además de enzimas recombinantes capaces de eliminar a la bacteria.

Este tipo de terapia es altamente efectiva, pero existe la posibilidad que debido a la alta tasa de mutación por parte de la bacteria Klebsiella pneumoniae, ésta buscará mecanismos para resistir a este tipo de terapia mediada por fagos, en contra de los más poderosos bacteriófagos líticos KP15 y KP27 actualmente.

Links de referencia:

- https://rd.springer.com/article/10.1007/s00253-016-7928-3

- https://rd.springer.com/article/10.1186/s13068-018-1100-5

Fig. 1. Proceso en la técnica de edición genómica CRISPR

 
Fig. 2. Resultado en el ADN luego de la técnica denominada CRISPR

 
Fig. 3. Comparación del genoma del Klebsiella pneumoniae y los fagos KP15 y KP27

Terapia regenerativa para neumonía por Klebsiella pneumoniae

La terapia regenerativa es una forma de mejorar la calidad de vida en la enfermedad de un paciente, ya sea tratándola o incluso curándola por completo de la misma, en nuestro caso es neumonía por Klebsiella pneumoniae, para lo cual se puede realizar por medio de Stem Cells del pulmón y Stem Cells de médula ósea, por lo tanto hablaremos acerca de estos tratamientos con Stem Cells que permite inhibir o curar la lesión dada por la bacteria causal y para esto se deberán seguir los siguientes procedimientos: 

- Terapia regenerativa con Stem Cells pulmonares:

1. Primero se infectaron a ratones genéticamente humanizados con la bacteria causante de la neumonía.
2. Se obtuvieron Stem Cells pulmonares de los nichos ubicados en la unión de conductos bronquio-alveolares, por medio de broncoscopía o lavado bronquial y de la sangre se cultivaron factores como TSP-1 para los siguientes pasos del proceso.
3. Se cultivaron las Stem Cells pulmonares obtenidas en el paso anterior con los factores obtenidos de la sangre como: TSP-1, BMP-4, NFAT-1, NOG, LuMECs, entre otros.
4. Se inyectó a los ratones esta fórmula de Stem Cells más los factores y se encontró un aumento significativo del factor TSP-1, que regulaba la regeneración del tejido pulmonar dando como resultado el mejoramiento de la enfermedad, en este caso de neumonía.
5. En conclusión, existe regeneración de tejido pulmonar ante el factor TSP-1, principalmente cuando hay lesión pulmonar. Estos estudios se usarán para el diagnóstico y tratamiento de enfermedades pulmonares como por ejemplo mediante la creación de fármacos capaces de incrementar el factor TSP-1 para sanar lesiones pulmonares.

- Terapia regenerativa con Stem Cells de médula ósea:

1. En primer lugar, se infectaron a ratones con la bacteria Klebsiella pneumoniae, para que desarrollen la neumonía.
2. Se preparan las Stem Cells de médula ósea que se obtienen sacando con agujas de la cadera de un donante y se coloca en unas columnas especiales para obtener solo las células madres. Otra forma de obtenerlas es darle un medicamento al donante para estimular la producción de las mismas y así tenga un mayor número de Stem Cells en la sangre, de ahí se saca por medio de catéteres grandes, uno en el brazo y se almacenan para sacar las células madres.
3. Se cultivaron las células en placas para aumentar su número y su eficacia por medio de factores como PaS.
4. Se tomaron Stem Cells de BM cultivadas en los ratones con neumonía para observar que factores aumentaban o disminuían como TNFα e IL-12p70.
5. Se realizaron métodos de inmuno-fluorescencia para detectar los marcadores que regulaban la reparación de tejido pulmonar afectado por la neumonía y a la vez inhibían el crecimiento bacteriano.
6. Los resultados arrojaron que al usar Stem Cells mesenquimales de médula ósea contra la neumonía causada por la bacteria Klebsiella pneumoniae nos da una reducción de TNFα y otras citoquinas pro-inflamatorias y por lo tanto menor inflamación alveolar, eliminación de bacterias de la superficie pulmonar y desaparición de pleuritis causada por bacterias.
7. En conclusión se vio una gran mejoría en la neumonía gracias al uso de Stem Cells de BM, por esta razón se están desarrollando tanto técnicas como posibles vacunas o fármacos que induzcan una mayor producción de estos factores que favorecerían a la eliminación de bacterias causantes de neumonía.

Links de referencia:

- https://rd.springer.com/article/10.1186/s12931-015-0288-1

- https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3951122/

 
Fig. 1. Método de obtención de Stem Cells

 
Fig. 2. Llegada de las Stem Cells a los pulmones y reparación de los mismos

 
Fig. 3. Acción de las Stem Cells a nivel molecular en la reparación del tejido pulmonar

Transgénicos estudiados en neumonía por Klebsiella pneumoniae + Ventajas y desventajas de los transgénicos

Debido a la múltiple resistencia por parte de la bacteria Klebsiella pneumoniae, se ha tratado de encontrar diversos métodos de combatirla tanto efectiva como eficazmente, por esta razón se analizaron los genes SP-A y sus variantes en ratones transgénicos humanizados, los cuales están presentes en la respuesta contra la bacteria, los resultados arrojaron que una mayor expresión de genes de variante SP-A2 tienen una mayor defensa que los SP-A1, por esta razón se ha buscado una forma de aumentar la expresión de estos genes con sustancias exógenas recombinantes como se hizo con los ratones con la metacolina, aumentando la resistencia pulmonar contra la bacteria Klebsiella pneumoniae.

Actualmente se está realizando una vacuna recombinante contra Klebsiella pneumoniae en la cual se encuentra la proteína recombinante GST-Kp1_p307 que busca que nuestro sistema inmune la recuerde y ataque en el caso de que se presente la bacteria con esta proteína, mientras que los estudios sobre los genes humanos en respuesta ante infección por Klebsiella pneumoniae, buscan mecanismos de regulación con sustancias externas recombinantes para una sobre-expresión de los mismos y así puedan combatirla incluso antes de que se tenga contacto directo con la bacteria.

Links de referencia:

- https://rd.springer.com/article/10.1186/s12931-018-0723-1

- https://rd.springer.com/article/10.1186/s12866-014-0321-4

- https://rd.springer.com/article/10.1186/1471-2334-14-456

 
Fig. 1. Respuesta de los genes SPA ante una infección por K. pneumoniae

 
Fig. 2. Estudio de la proteína recombinante GST-Kp1_p307

 
Fig. 3. Tratamiento de la infección por K. pneumoniae con gentamicina

 
Fig. 4. Pulmones de los ratones infectados por Klebsiella pneumoniae

Ventajas de los transgénicos

1. Permite obtener un conocimiento más detallado sobre la función de genes específicos.
2. Investigación más profunda de enfermedades tratables pero no curables como la fibrosis quística.
3. Búsqueda de tratamientos, mediante estudios en animales, para enfermedades poco tratables o no tratables como el Alzheimer.
4. Creación de fármacos o vacunas con mayor eficiencia para otorgar resistencia y/o inmunidad a determinadas enfermedades
5. En el ámbito nutricional, mejoramiento de la calidad y cantidad de un producto natural e incluso que ayude u otorgue un mejor desarrollo para los consumidores, tanto cognitivo como inmunológico.

 
Fig. 5. Tecnología usada para el ADN recombinante en alimentos

Desventajas de los transgénicos

1. Posible desarrollo de resistencia ante nuevos fármacos por parte de las bacterias usadas como vectores o usadas como receptoras.
2. Posible alteración en el genoma humano, como mutaciones o delecciones, por el consumo continuo de sustancias o alimentos recombinantes.
3. Alteraciones en la producción o en los receptores hormonales por el consumo de fármacos recombinantes.
4. Problemas medioambientales junto con ambición por el dominio mundial usando la tecnología recombinante para crear bacterias altamente mortales e iniciar guerras biotecnológicas.
5. Posible asociación de virus y bacterias que darían como resultado el desarrollo de nuevas enfermedades altamente mortales y desconocidas tanto en reconocimiento como en tratamiento.

 
Fig. 6. Exceso de recombinaciones en alimentos

ADN recombinante en la naturaleza y ADN recombinante artificial

ADN recombinante en la naturaleza

El ADN recombinante dentro de la naturaleza hace referencia a un cambio en alguna o algunas secciones de los cromosomas de un ser vivo con el fin de donar a sus futuras generaciones un mejor genoma con mayor resistencia o para dar variabilidad a la especie. Como ejemplo tenemos:

1. El crossing over que ocurre en la meiosis I, en la profase I en la subfase de paquiteno, en  los cromosomas sexuales de un ser vivo tanto masculino como femenino, lo cual confiere variabilidad en sus genes e incluso una mayor expresión de los mismo ante determinadas circunstancias.
2. El intercambio espontáneo que tienen las bacterias al conferir parte de su ADN por medio de plásmidos a otras bacterias para conferirles resistencia a fármacos a los que fueron expuestos y los otros no, y viceversa.

 
Fig. 1. ADN recombinante en el crossing over.

 
Fig. 2. ADN recombinante en las bacterias

 

ADN recombinante artificial

El ADN recombinante artificial tiene como finalidad usar aparatos altamente técnicos y desarrollados para introducir un segmento de ADN dentro de un ser vivo y que este adopte la función del mismo, dando como resultado la proteína que tiene a cargo el gen que se introdujo en el ser vivo. Como ejemplos tenemos:

1. Uso de los mecanismos de bacterias como Escherichia coli para la producción de proteínas, como la insulina, debido a que es fácilmente manipulable y que sus genes permiten hacer estas modificaciones, además de que ayuda al tratamiento de algunas enfermedades, en el caso de la insulina con la diabetes tipo 1.
2. Modificación de algunas especies vegetales como en las últimas investigaciones con Physcomitrella patens, la cual se la está utilizando para la creación de fragancias, sabores y materias primas renovables, este planta entra en la categoría de los transgénicos que se encuentran en desarrollo.

Fig. 3. Método de ADN recombinante con E. coli

Fig. 4. Método de elaboración de los alimentos genéticamente modificados, llamados transgénicos

Links de referencia:

- https://link.springer.com/article/10.1007%2Fs00425-018-3053-0

- http://scielo.sld.cu/pdf/rhcm/v16n3/rhcm11317.pdf

- http://www.scielo.br/pdf/aabc/v86n4/0001-3765-aabc-0001-3765201420130106.pdf

- http://scielo.sld.cu/pdf/vac/v22n2/vac06213.pdf

- http://www.scielo.br/pdf/hcsm/v20n4/0104-5970-hcsm-20-04-01453.pdf

Northern blot en neumonía por Klebsiella pneumoniae

Para usar la técnica de hibridación northern en Klebsiella pneumoniae, se realizaron los siguientes pasos:

1. Se realizó el aislamiento de ARN, por medio de líquido bacteriano de cultivos usando el kit RNeasy.
2. Después se usó 2 ug de ARN en gel de agarosa al 1% con formaldehído al 1,2% durante una hora.
3. Posteriormente pasó por la membrana de nylon Porablot con sondas de hibridación que detectaron los genes ramA, acrB y rrsE, los cuales fueron cortados por la enzima EcoRI.
4.  Se etiquetaron los genes usando el sistema Megaprime DNA.

Las membranas de nylon fueron pre-hibridadas a 65 ℃ en un tubo con 10 ml de Speed-HybII al 7%, durante 1 hora, se usaron sondas específicas para los genes. Posteriormente se lavaron las membranas de nylon tres veces a 65 ℃ durante 15 minutos y finalmente expuestas a autorradiografía Kodak MS.

Links de referencia:
- http://www.newmicrobiologica.org/PUB/allegati_pdf/2017/2/135.pdf

- https://www.researchgate.net/publication/271593340_Elucidation_of_the_RamA_Regulon_in_Klebsiella_pneumoniae_Reveals_a_Role_in_LPS_Regulation

- https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3136514/

Fig. 1. Pasos de la técnica Northern blot.

 
Fig. 2. Resumen de los pasos de la técnica Northern blot.

Fig. 3. Resultados del Northern blot en Klebsiella pneumoniae.

Prueba de PCR en neumonía por Klebsiella pneumoniae

Para la caracterización de cepas de Klebsiella pneumoniae se usaron hemocultivos de pacientes que se sospechaba adquirieron el patógeno mencionado y se aplicaron dos técnicas de PCR: análisis por PCR de los elementos repetitivos intergénicos consenso de enterobacterias (ERIC) y elementos repetitivos extragénicos palindromos (REP), conocidas también como ERIC-PCR y REP-PCR, respectivamente, para el uso de estos tipos de PCR se procedió con los siguientes pasos:

1. Extracción de ADN genómico bacteriano de Klebsiella pneumoniae empleando el kit basado en columna de Sílica, QIAamp DNA extraction Kit (Qiagen).

2. Se realizó ambas PCR con el método del autor que consistía en:

    Para ERIC-PCR: 

    - 1 ciclo de 7 minutos a 95 ℃.

    - 30 ciclos de: 

       - Desnaturalización: 1 minuto a 94 ℃.

       - Hibridación: 1 minuto a 40 ℃.

       - Elongación: 8 minutos a 65 ℃.

    - 1 ciclo de extensión final de 16 minutos a 65 ℃.

   Para REP-PCR: 

    - 1 ciclo de 7 minutos a 95 ℃.

    - 30 ciclos de: 

       - Desnaturalización: 30 segundos a 90 ℃.

       - Hibridación: 1 minuto a 43 ℃.

       - Elongación: 8 minutos a 65 ℃.

    - 1 ciclo de extensión final de 16 minutos a 65 ℃.

3. Se usó la enzima de restricción Xbal, se buscaron los genes BLEE y bla.

4. La observación se la realizó por medio de electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE)

5. Terminada la electroforesis, el gel se tiñó con una solución de bromuro de etidio durante 30 minutos; luego se realizó dos lavados con agua destilada durante 15 minutos cada lavado, y la imagen del gel fue registrada por el foto documentador Chemi Doc XRS.

La razón por la cual se usa este tipo de electroforesis, es porque este método es recomendado para la confirmación de brotes causados por Klebsiella pneumoniae. Esta investigación tenía como tema diagnosticar las diferentes cepas de Klebsiella pneumoniae, y entre sus objetivos disminuir y tratar las neumonías dadas por esta bacteria Gram-negativa. Tanto la especificidad como sensibilidad analítica no se especifica en los artículos que busqué.

Links de referencia:
- http://www.scielo.org.pe/pdf/rmh/v24n2/v24n2ao1.pdf
- https://scielo.conicyt.cl/pdf/rci/v30n4/art04.pdf
- http://www.medigraphic.com/pdfs/micro/ei-2014/ei143d.pdf
- http://www.scielo.org.co/pdf/bio/v35n4/v35n4a07.pdf

Fig. 1. Reacción en Cadena de Polimerasa

Fig. 2. Pasos de la Reacción en Cadena de Polimerasa

Fig. 3. Uso de los primers para la amplificación de genes y EFO en la PCR

Fig. 4. Caracterización de las cepas de Klebsiella pneumoniae

Prueba de tamizaje y confirmatoria para neumonía por Klebsiella pneumoniae

Dentro de algunas pruebas de tamizaje para Klebsiella pneumoniae están: test de Jarlier, los test Carba, test de Hodge, Agar ChromID CARBA® y tiras epsilométricas, las cuales usan discos de medicamentos como las cefalosporinas, dependiendo del halo formado se detecta el tipo de bacteria. Entre algunas pruebas confirmatorias para Klebsiella pneumoniae están: uso de discos de cefotaxima y ceftazidima, combinadas con ácido clavulánico, prueba de detección de KPC basada en boronatos, entre otras.

Links de referencia:

- https://scielo.conicyt.cl/pdf/rci/v35n3/0716-1018-rci-35-03-0253.pdf

- http://www.ispch.cl/sites/default/files/Recomendaciones%20para%20detecci%C3%B3n%20carbapenemasas%20en%20enterobacterias%20y%20pseudomonas%20aeruginosa..pdf

- http://www.medigraphic.com/pdfs/infectologia/lip-2017/lip173e.pdf

- http://www.scielo.org.co/pdf/inf/v17n2/v17n2a06.pdf

- http://scielo.sld.cu/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1729-519X2010000400011

- http://aprendeenlinea.udea.edu.co/lms/moodle/mod/page/view.php?id=100919

Fig. 1. Control positivo y negativo por medio del uso de fármacos específicos

Fig. 2. Procedimiento del método de Hodge con Tritón X-100

Fig. 3. Método de detección de EPC por visualización del color

Fig. 4. Esquema de interpretación en tiras epsilométricas

Alteración epigenómica de neumonía por Klebsiella pneumoniae

En este escenario tenemos dos actores: la bacteria y el huésped, en el caso de la bacteria Klebsiella, generalmente usa mecanismo de metilación cuando ingresa al huésped para aumentar el número y así su virulencia, en el caso del huésped, debido a que se encuentra debilitado por la neumonía, ésta contribuye a infecciones parasitarias ya que su sistema inmune no se encuentra totalmente funcional, dejándolo susceptible a otros agente patógenos como: Ascaris lumbricoides, Entamoeba histolytica, etc.

Links de referencia:

- http://scielo.isciii.es/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1134-80462018000300166&lng=es&nrm=iso

- http://scielo.sld.cu/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1817-59962015000400008

- http://www.scielo.org.co/pdf/bio/v35n4/v35n4a07.pdf

- http://diposit.ub.edu/dspace/bitstream/2445/101727/1/MCG_TESIS.pdf

- http://www.redalyc.org/pdf/3729/372950032002.pdf

- http://scielo.sld.cu/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1029-30432013000100008

- http://www.scielo.org.ar/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0325-00752012000200009

Fig. 1. MicroRNA luego de los procesos moleculares 

Fig. 2. Mecanismos de la transcripción

Fig. 3. Mecanismo de metilación en el ADN

Alteraciones en la traducción en neumonía por Klebsiella pneumoniae

La bacteria Klebsiella pneumoniae no altera la traducción normal de las células de su huésped, pero una vez que ya formó la biopelícula, colonizó, comienza la formación de la matriz para mantener la virulencia en el hospedador, por la inducción de AMPs y de ILs del huésped, la bacteria traduce más CPS, bombas de expulsión AcrAB, mayor antígeno OmpA y OmpK con forma de barril β, para aumentar la integridad celular, resistencia, conjugación, división celular y capacidad de invadir células hospedadoras.

Links de referencia:
- http://dspace.uib.es/xmlui/bitstream/handle/11201/1699/TFG_GBIO_SofiaTejadaMagraner.pdf?sequence=1&isAllowed=y
- http://www.scielo.org.pe/pdf/rmh/v24n2/v24n2ao1.pdf
- http://www.revinfcientifica.sld.cu/index.php/ric/article/view/1185/2196
- http://ibdigital.uib.cat/greenstone/collect/tesisUIB/index/assoc/Martinez/_Moliner.dir/Martinez_Moliner_Veronica.pdf

Fig. 1. Mecanismo de acción de las ILs y citoquinas

Fig. 2. Formación de OMVs para la evasión del sistema inmune

Fig. 3. Vesícula formada para la evasión del sistema inmune

Alteraciones de la transcripción en Neumonía por Klebsiella pneumoniae

La bacteria Klebsiella pneumoniae comienza adheriéndose a las células por medio de fimbrias tipo 1, 3 y antígenos K1 y K2, luego coloniza, formando proteínas Mrk, del operón mrkABCDF, el gen mrkD es el más diverso, ya sintetizadas las proteínas y desdoblado el ADN para la transcripción, expresan SPE para el quorum sensing y así aumentar la colonización y virulencia. Las bombas de expulsión RND, regulada por los factores de transcripción AraC/XyIS, les permite ser multirresistentes a los antibióticos.

Links de referencia:

- http://repository.javeriana.edu.co/bitstream/10554/15426/1/HuertasValeroMonicaGabriela2014.pdf
- https://scielo.conicyt.cl/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0716-10182013000400004

- https://scielo.conicyt.cl/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0716-10182012000200009

- http://www.mufm.fr/sites/mufm.univ-toulouse.fr/files/Activites/Simposio2016/Memorias/Salud/juan_carlos_jimenez_castellanos.pdf

Alteraciones genómicas/replicación en neumonía por Klebsiella pneumoniae

La bacteria Klebsiella pneumoniae presenta una gran variedad de cepas debido a su modificación o alteración en sus genes de la pared celular, como el gen que codifica β-lactamasas, a partir del alelo SHV-1, muta y se convierte en un nuevo gen SHV, el gen en bla_KPC, localizado en el transposón Tn4401, los genes del componente C3, antígenos K1, K2 y O, mutan cambiando grupos de oligopolisacáridos, que se encuentran en plásmidos o transposones, que aumentan su resistencia y virulencia.

Links de referencia:

- https://scielo.conicyt.cl/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0716-10182017000500476
- http://ibdigital.uib.cat/greenstone/collect/tesisUIB/index/assoc/Martinez/_Moliner.dir/Martinez_Moliner_Veronica.pdf

- http://www.scielo.org.mx/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0036-36342009000900009
- http://www.scielo.org.pe/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1726-46342003000300002

- https://www.tdx.cat/bitstream/handle/10803/2383/TOL211.pdf

Fig. 1. Mutación de ADN lineal de la mayoría de bacterias.

Fig. 2. Mutación de un alelo atacado por un antibiótico y que se hizo resistente por la mutación.

Fig. 3. Sistema de mutación por medio de plásmidos y pared celular.

Fig. 4. Sistema de activación del complemento de la bacteria.

Neumonía por Klebsiella pneumoniae

La neumonía es una infección a los alvéolos pulmonares, que se da por la colonización de bacterias causantes de la misma, entre las cuales se encuentra Klebsiella pneumoniae, la cual es una bacteria de tipo gramnegativa, que se caracteriza por invadir el cuerpo cuando las defensas se encuentran disminuidas, es decir, es una bacteria oportunista, por esta razón es que este tipo de neumonía se da mayormente en personas de la tercera edad que tienen un sistema inmunológico debilitado.

Links de referencia:

- https://medlineplus.gov/spanish/pneumonia.html

- https://codeinep.org/wp-content/uploads/2017/02/Klebsiella_pneumoniae_ii.pdf

- http://microbiologia2a.blogspot.com/2013/04/klebsiella-pneumoniae.html

Neumonía.
Tomado de: https://medlineplus.gov/spanish/ency/images/ency/fullsize/19680.jpg

                                            Klebsiella pneumoniae
Tomado de: https://images.islalocal.com/2017/11/Klebsiella-pneumoniae.jpg

Saludo de bienvenida

Se dedica esta bienvenida a todos los usuarios que se encuentran interesados en el aprendizaje de la biología molecular, con el fin de que todos, tanto estudiantes como docentes, aprendamos más acerca del mundo que nos rodea y su constitución. Les da un cordial saludo el creador de este blog: Ronald Moreno Muñoz. De antemano a toda persona que visite mi blog les deseo éxitos en sus metas establecidas.